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超滤离心管怎么使用?
【求助】Millipore超滤离心管想重复使用,请问如何清洗和保存?
【回答精要】
使用后用0.1M NaOH泡24h,然后20%乙醇浸泡保存。
 
这个我是听老板们说的,的确乙醇泡完后孔径会增大本就是5-10KD最大,也就是说如果你的蛋白在21KD以上,应该没问题。或者可以不用乙醇泡,用NaOH洗之后直接用无菌水保存,每周换一下液体,应该没有问题。
 
看看说明书不就结了!我原来在CRO的时候一直是重复用的,也没见什么不好啊!短期会用的话,用20%的乙醇泡着,回头拼命用millipore的水充干净,然后在用样品缓冲液平衡一下就好,至于有些人说的改变孔径,也没那么大影响的,你至少跟目的蛋白分子量差别3倍的截留分子量才安全的不是吗?1个月以内不用的话,建议用100mM的NaOH保存!更长时间的话加0.02%的叠氮钠,但那个东西强致癌物,不建议使用。
 
理论上截留目标物,孔径应选1/3~1/5的膜;透过目标物,孔径应选5-10倍的膜。
 
【求助】准备用millipore 的超滤离心管从细胞培养上清液中浓缩蛋白,在园子里找到一些关于浓缩蛋白的一些帖子,但还有些问题还是向园子里的大虾请教一下。我们定的是Amicon Ultra 15ml规格的管子,不知道有没有谁以前做过的,有关于转速,时间给一些建议,另外细胞上清液离心前是否需要什么预处理?离心之后回收蛋白时怎么尽量减少损失?如果要把管子重复利用,NaoH清洗后,如何在20%的乙醇中保存?是将其浸到乙醇中防于4度,还是在管子中灌入乙醇?
 
【回答精要】
 
我用过5ml的管子,当时使用的转速是4000rpm 8min,可以把5ml的样品液浓缩到约200ul,这仅供参考,具体情况还要由您的样品决定。
 
我保存5ml管子的方法是把内管取出,浸泡于装有20%乙醇的烧杯中。四度保存。
 
该种管子可以脱盐浓缩但不宜根据截留半径做分离蛋白用。
 
我用的是3500g,4度离心,时间可以自己控制,取决于你最终的浓缩体积,我一般是200ul左右。
 
千万别一下离心时间太长,不同的蛋白浓缩的速度不同,有的需要长时间离心,有的则一下子就好。当然也和你的蛋白是否比较纯,所用的是什么buffer,还有蛋白的浓度有关系。所以离心时要先短些时间观察一下你的浓缩速度,不要一下子浓缩过了,甚至形成沉淀就得不偿失了。
 
另外其实他们的管子都设计的是一次性使用,所以如果想重复使用,不要离得速度太高,4000-4500RPM就差不多了,另外重复使用时要看看管壁上有没有裂纹,现在的管子好像不如从前的结实了。
 
用后把管子用纯水洗干净,离心少时,洗一下膜,再象propeg主任说的那样收起来即可。使用多次后若觉得有些堵,就可以用NaOH泡泡,离心几分钟,应该会有改善。
 
 
纯化多肽,截断分子量可以选10倍,纯化球蛋白,截断分子量可以选3倍,如管子要重复使用,转速设最大转速(G)的80%左右,不然时间长了塑料就裂了,膜也容易出问题。
 
离心后管子用MilliQ水清洗干净,浸泡在水中,4度保存就行了,不放心就放点防腐剂,但是这个管今后只能用来离心同类的样品哦。
超滤损失蛋白是正常的,样品体积大就分批离心,别搞的离心时间太长,样品里的杂质如果可能尽量在离心前去除一些。
编辑: viviank